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香叶木素对肺腺癌细胞的抑制作用及其分子机制的实验研究
编辑: admin 来源: 未知 时间: 2020/7/3 3:20:44

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【摘要】:目的:观察香叶木素对人肺腺癌细胞系的增殖抑制作用及其诱导人肺腺癌细胞株凋亡的分子机制;采用裸鼠动物模型验证香叶木素对肺腺癌的抑制作用;观察香叶木素调控人肺腺癌细胞株的表观遗传学改变,以期为香叶木素在肺癌治疗的临床应用中提供理论依据。 方法:选用人肺腺癌细胞系HCC827、A549,以显微镜观察细胞形态;以MTT和CCK-8法测定细胞的增殖;流式细胞仪测定细胞凋亡与细胞周期;Westernbloting检测凋亡相关蛋白及相关周期蛋白的表达水平;Transwell法检测细胞的侵袭能力;siRNA干扰特异基因p53的表达并应用RT-qPCR与Westernbloting法检测相关基因的表达;免疫荧光技术观察p53相关磷酸化位点的改变;体内小鼠成瘤实验观察香叶木素的治疗作用;芯片法检测香叶木素对人肺腺癌细胞系HCC827、A549mRNAs,miRNAs和lncRNAs表达的影响。 结果:1.香叶木素对人肺腺癌细胞系HCC827、A549细胞的24h的IC50为35μM和43μM。

香叶木素作用HCC827和A549细胞后,细胞形态学变化明显。 随着香叶木素浓度的增加,细胞凋亡率也随之增加。 HCC827对照组浓度为0μmol/L时细胞凋亡率为(±)%,浓度为5μmol/L时细胞凋亡率为(±)%,浓度为10μmol/L时细胞凋亡率为(±)%,浓度为20μmol/L时细胞凋亡率为(±)%;而对应浓度A549细胞的凋亡率分别为(±)%、(±)%、(±)%、(±)%,各组与对照组相比差别均有统计学意义()。

结果表明香叶木素能够诱导人肺腺癌HCC827和A549细胞凋亡,且随药物浓度升高细胞凋亡越明显。

20M的香叶木素可以明显抑制人肺腺癌HCC827和A549细胞的侵袭能力,HCC827细胞对照组穿膜细胞平均为21±个,香叶木素处理组穿膜细胞平均为9±。

A549细胞对照组穿膜细胞平均为23±个,香叶木素处理组穿膜细胞平均为11±个,差异显著()。 在HCC827和A549细胞系中,各香叶木素处理组(5μM、10μM、20μM)中均检测出凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平下调,而Bax、Bad、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-7、cleaved-PARP的表达水平上调,香叶木素可能通过caspase通路促进细胞凋亡的。 香叶木素(0μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L)作用HCC827细胞24h后,细胞的增殖抑制率分别为(±)%、(±)%、(±)%、(±)%,而A549细胞增殖抑制率分别为(±)%、(±)%、(±)%、(±)%。 由此可见,香叶木素能够抑制人肺腺癌HCC827、A549细胞的增殖活性,且具有显著的量效关系。 在HCC827、A549细胞系中,经香叶木素处理24h后,随着药物浓度的增高细胞阻滞于G2/M期的现象越来越明显。 香叶木素作用前后肺癌细胞系HCC827和A549细胞周期蛋白cyclinB1、cdc2、CDC25B、CDC25C和CAK蛋白的表达水平下调,而14-3-3σ、Wee1、p53、p21的表达水平上调。

RNAi沉默p53阻断香叶木素介导p53/p21(waf1)信号通路。

香叶木素作用前后HCC827、A549细胞中的p53相关磷酸化位点发生了改变。 2.通过对裸鼠肺部原位致瘤模型不同剂量的香叶木素灌饲,发现100mg/kg香叶木素治疗组小鼠在体重、平均存活时间、肿瘤体积、重量和淋巴转移方面均有明显改善,具体如下:HCC827细胞成瘤组,小鼠体重为治疗组,对照组。 A549细胞成瘤组,小鼠体重为治疗组,对照组。

HCC827细胞成瘤组,平均瘤重为治疗组,对照组。 A549细胞成瘤组,平均瘤重为治疗组,对照组。

HCC827细胞成瘤组,平均肿瘤体积为治疗组,对照组。 A549细胞成瘤组,平均肿瘤体积为治疗组,对照组。

HCC827细胞成瘤组,小鼠平均存活时间为治疗组624d,对照组513d。

A549细胞成瘤组,小鼠平均存活时间为治疗组735d,对照组493d。

3.香叶木素处理A549和HCC827细胞后,mRNAs,miRNAs和lncRNAs表达有明显差异。

结论1.香叶木素对人肺腺癌HCC827和A549细胞系均具有增值抑制和促进调亡的作用,可能是通过caspases通路的活化促进细胞凋亡和通过调节p53/p21等周期蛋白的表达水平使细胞周期阻滞于G2/M期从而抑制细胞增殖。

2.裸鼠动物模型实验证实香叶木素对肺腺癌细胞有明显的抑制作用。 3.香叶木素可调控人肺腺癌HCC827和A549细胞系的表观遗传学改变,此改变为更深入了解香叶木素作用于人肺腺癌细胞系的表观遗传学分子机制提供了线索。 总之,本研究系统地观察了香叶木素对人肺腺癌细胞的抑制作用,初步明确了其分子机制,为香叶木素在肺癌治疗的临床应用中提供了重要的理论依据。

【学位授予单位】:暨南大学【学位级别】:博士【学位授予年份】:2017【分类号】:。

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